Персонифицированный иммуноген для элиминации сенесцентных клеток

Видео: VK Video, RuTube, YouTube

Аудио: mvave, Я.Музыка, Spotify

Современные подходы к борьбе за активное долголетие постепенно смещаются от универсальных решений к персонализированной терапии. Одним из наиболее перспективных направлений считается создание индивидуальных иммуногенов, способных обучать иммунную систему распознавать и элиминировать сенесцентные (стареющие) клетки.

Такой подход разработан отечественными учёными под руководством кандидата биологических наук, биохимика, генетика и биоинженера Ильи Владимировича Духовлинова. Технология предусматривает создание персонифицированного иммуногена для каждого пациента на основе индивидуальных особенностей старения организма.

В доклинических исследованиях на мышах она продемонстрировала увеличение средней продолжительности жизни животных примерно в 1,5 раза – до 3,2 лет.

Параллельно в России готовятся законодательные изменения, направленные на упрощение регистрации препаратов персонифицированной генной терапии. Речь идёт о проекте № 167228, предусматривающем внесение изменений в Федеральный закон № 61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств».

Основные механизмы старения

Несмотря на существование сотен теорий старения, их можно разделить на два основных кластера:

• повреждения ДНК, включая депуринацию, различные типы разрывов, точечные мутации;
• накопление факторов клеточной сенесценции;

Некоторые исследователи также выделяют третий кластер механизмов старения, который трактуется по-разному. Владимир Фокин относит к нему нарушение клеточной аутокооперации.

Если говорить о повреждении ДНК, ежедневно в наших клетках происходит более 6 000 спонтанных депуринаций. При этом общее количество разных повреждений ДНК оценивается минимум в 10 000, а по факту может достигать и 100 000. С возрастом их число увеличивается.

В 2012 году на модели гепатоцитов было показано, что к 80-летнему возрасту каждая соматическая клетка накапливает около 5 000 мутаций. Если такие изменения затрагивают кодирующие участки генома, это может привести к нарушению синтеза и функций соответствующих белков.

С 2014 года значительно активизировались исследования радиозащитных молекул, а также молекул, способных предотвращать повреждение ДНК и усиливать механизмы её репарации. Одним из наиболее перспективных соединений в этом направлении считается Флагеллин. Разработка принадлежит отечественным учёным. Первые исследования Флагеллина проводились группой Андрея Владимировича Гудкова. Впоследствии уже группа Ильи Владимировича Духовлинова разработала усовершенствованную версию Флагеллина.

Факторы клеточной сенесценции

На сегодняшний день механизмы клеточной сенесценции изучены достаточно подробно. Переход клетки в сенесцентное состояние сопровождается остановкой роста и деления, изменением профиля экспрессии генов, формированием характерного секреторного фенотипа и появлением специфических поверхностных маркеров.

Сенесцентные клетки приобретают так называемый секреторный фенотип, ассоциированный со старением (SASP, Senescence-Associated Secretory Phenotype). Они начинают активно выделять широкий спектр веществ (SASP-белки и др.), поддерживающих хроническое воспаление и оказывающих токсичное влияние на окружающие ткани. К компонентам SASP относятся провоспалительные цитокины (IL-6, IL-1α, TNF-α), хемокины (IL-8, MCP-1), неоднозначные факторы роста (TGF-β, VEGF), матриксные металлопротеиназы (MMP-1, MMP-3, MMP-13).

Также особенностью сенесцентных клеток является экспрессия специфических белков-маркеров, позволяющих отличать их от обычных клеток. К ним относится, например, SA-β-Gal (β-галактозидаза) – фермент, который накапливается в лизосомах стареющих клеток вследствие их избыточной активности. А также CD87, CD153, GPNMB, CD9, KLRG1 и ряд других белков.

Самым известным маркером является CD87 – рецептор активатора плазминогена урокиназы (uPAR).

В норме соматические клетки обладают ограниченным числом делений (число Хейфлика). После его достижения клетки утрачивают способность к делению и постепенно элиминируются иммунной системой. Однако часть таких клеток может переходить в состояние сенесценции (клетки-зомби), сохраняя метаболическую активность, но утрачивая способность к делению и апоптозу. Именно такие клетки характеризуются экспрессией CD87, а также других маркеров сенесценции.

Элиминация сенесцентных клеток

Элиминация сенесцентных клеток рассматривается как один из наиболее перспективных подходов к профилактике возраст-ассоциированных заболеваний.

Сейчас активно исследуются различные сенолитики, в том числе так называемые малые молекулы (фисетин, кверцетин, дазатиниб). Однако их применение имеет ряд существенных ограничений.

Прежде всего, малые молекулы обладают низкой специфичностью. Известно множество маркеров сенесцентных клеток, и набор таких маркеров индивидуален для каждого человека. Именно поэтому сенолитическая терапия должна быть персонифицированной.

Кроме того малые молекулы могут вызывать серьёзные побочные реакции. Многие из исследуемых сенолитиков – это противоопухолевые препараты, вызывающие тромбоцитопению и другие нежелательные эффекты.

Даже более сложные клеточные технологии, такие как CAR-T-терапия, не решают эту проблему полностью. Химерные антигенные рецепторы позволяют распознавать лишь ограниченное число мишеней, тогда как сенесцентные клетки характеризуются большим разнообразием маркеров.

Разработка Ильи Духовлинова: персонифицированный иммуноген

Группой Ильи Владимировича Духовлинова разработана платформа для конструирования персонифицированных комбинированных вакцинных антигенов, предназначенных для избирательной элиминации сенесцентных клеток с учётом индивидуальных тканеспецифичных мишеней каждого пациента.

Принцип метода состоит в обучении иммунной системы распознавать и уничтожать сенесцентные клетки. По аналогии с вакцинацией, когда адаптивный иммунитет учится справляться с патогеном, иммунная система получает информацию, позволяющую отличать клетки-зомби от здоровых клеток.

Основой иммуногена служит плазмидная ДНК, содержащая универсальные сайты для вставки генов-мишеней. Плазмиды – это небольшие циклические структуры, характерные для бактерий и архей, которые часто используются в качестве векторов доставки. Использование плазмидной ДНК позволяет избежать многих фармакокинетических проблем и токсичности. При этом такая плазмида не встраивается в геном человека.

Подбор мишеней-антигенов осуществляется индивидуально по результатам комплексного обследования пациента. Учитываются биомаркеры клеточной сенесценции (p16, p21), маркеры SASP, данные транскриптомного и протеомного анализа, клинический диагноз, признаки иммунного старения, метаболические нарушения.

Следующим этапом становится комбинирование выбранных мишеней и конструирование белковых последовательностей – иммуногенных эпитопов, распознаваемых цитотоксическими и хелперными Т-лимфоцитами.

Первый этап: индивидуальный паспорт старения

Для создания персонифицированного иммуногена на первом этапе проводится комплексное обследование пациента, цель которого – определить индивидуальный профиль клеточной сенесценции и подобрать мишени для будущего иммуногена.

Подготовка включает три блока исследований:

• клинико-анамнестический – сбор жалоб, оценка коморбидного фона (атеросклероз, саркопения, остеоартрит, неалкогольная жировая болезнь печени, сахарный диабет 2 типа, нейродегенеративные заболевания и др.), а также инструментальные методы диагностики (УЗИ сосудов, денситометрия, биоимпедансометрия, при необходимости – МРТ и ПЭТ);
• лабораторный – определение биомаркеров клеточной сенесценции (p16INK4a, p21), маркеров SASP, проведение транскриптомного анализа для выявления тканеспецифичных сигнатур сенесценции и протеомного анализа для поиска потенциальных антигенных мишеней стареющих клеток (uPAR, GPNMB, B2M, DPP4 и др.);
• оценка иммунного и метаболического статуса, включающая иммунофенотипирование, анализ признаков иммунного старения и метаболических нарушений.

Важным исследованием является РНК-секвенирование клеток периферической крови, позволяющее определить, какие белки сенесцентных клеток экспрессируются у конкретного пациента и какие нужно атаковать. Дополнительно могут оцениваться маркеры SASP, длина теломер и другие показатели биологического старения. Одним из наиболее востребованных мог бы стать тест на определение объёма повреждений ДНК, однако в доступной версии его пока нет.

В соответствии с результатами обследования формируется персонифицированный паспорт старения человека, отражающий перечень тканеспецифичных мишеней, степень их экспрессии и ткани, в которых они представлены (жировая, сосудистая, печёночная, синовиальная, мозговая и др.).

Затем с исползованием алгоритмов биоинформатического анализа (NetMHCpan, IEDB, TEPredict) с учётом HLA-генотипа пациента прогнозируются иммуногенные эпитопы, распознаваемые CD8+ цитотоксическими и CD4+ хелперными Т-лимфоцитами. Так формируется конструкция будущего персонифицированного иммуногена.

Разработка и контроль качества персонифицированного иммуногена

На основе индивидуально подобранных эпитопов конструируется синтетический ген. Собирается гибридная последовательность: сигнальный пептид + (эпитоп1–линкер–эпитоп2)n + адъювантный домен. В качестве иммунных энхансеров используются белковые компоненты, в частности флагеллин.

Затем проводится оптимизация кодонов для эффективной экспрессии в клетках человека и синтез молекулы ДНК с последующим клонированием в экспрессионный плазмидный вектор, содержащий сайт для направленной вставки, промотор CMV и поли(А)-сигнал. Дополнительно включается сигнальная последовательность, обеспечивающая секрецию антигена. Контроль правильности сборки конструкции осуществляется секвенированием.

После этого плазмидный вектор размножают в бактериях Escherichia coli, а затем выделяют и очищают для получения препарата.

Готовый персонифицированный иммуноген проходит предварительную проверку на аутологичных клетках пациента. Для этого выделяют мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) и получают культуру фибробластов, в которой in vitro индуцируют клеточную сенесценцию. Проводят трансфекцию плазмиды в аутологичные дендритные клетки и оценивают результат.

Контроль качества включает оценку специфической цитотоксичности (CD8+ Т-клетки, высвобождение гранзима B, перфорина), эффективности элиминации сенесцентных клеток и отсутствия лизиса здоровых фибробластов.

Таким образом, разработанный иммуноген не только прогнозируется с использованием биоинформатических методов, но и проходит экспериментальную верификацию до применения.

Введение иммуногена пациенту и контроль эффективности

После завершения разработки и валидации персонифицированный иммуноген вводят пациенту внутримышечно в дозе 1–2 мг плазмидной ДНК. Схема иммунизации включает первичную инъекцию (день 0) и две ревакцинации – на 21-й и 42-й день.

На протяжении всего курса проводится мониторинг безопасности и эффективности терапии в дни 0, 7, 21, 42, 90, 180 и 360. Безопасность оценивают по данным общего анализа крови, уровням С-реактивного белка, прокальцитонина, интерлейкина-6, печеночных ферментов, креатинина, а также электрокардиографии.

Иммунный ответ контролируют методом ELISpot с определением продукции IFN-γ в ответ на целевые эпитопы.

Эффективность сеноэлиминации оценивают по снижению p16INK4a и факторов SASP в плазме через 4–8 недель. Дополнительно могут использоваться инструментальные и функциональные методы оценки, включая ультразвуковое исследование сосудов, биоимпедансометрию, тест шестиминутной ходьбы, а при согласии пациента – биопсию тканей для прямого подсчета снижения числа p21+ клеток.

По результатам обследования принимается решение о необходимости введения бустерных доз.

Весь цикл – от первичного обследования пациента до первой инъекции – занимает в среднем 6–8 недель. Для сокращения сроков разработки возможно использование заранее подготовленных библиотек эпитопов для наиболее распространённых HLA-типов и часто встречающихся молекулярных мишеней.

Первые результаты

Первые результаты применения персонифицированного иммуногена на людях подтверждают эффективность подхода. В одном из исследований по данным ультразвукового исследования сонной артерии через 1,5 месяца после иммунизации было отмечено уменьшение объёма атеросклеротической бляшки на одну треть.

Ещё одним результатом действия иммуногена является увеличение длины теломер. Теломеры – это концевые участки хромосом, защищающие ДНК от повреждений. Их укорочение считается одним из признаков биологического старения. После введения персонифицированного иммуногена наблюдалось увеличение длины теломер по сравнению с исходным уровнем до вакцинации.

Преимущества персонифицированного иммуногена

Высокая специфичность. Индивидуальный подбор антигенных мишеней позволяет учитывать особенности процессов старения у каждого пациента и направленно устранять именно те сенесцентные клетки, которые преобладают в его организме.

Продолжительный эффект. Формирование иммунологической памяти обеспечивает сохранение иммунного ответа в течение 12–24 месяцев, что потенциально позволяет проводить повторную иммунизацию лишь раз в несколько лет.

Профилактика возраст-ассоциированных заболеваний. Направленная элиминация сенесцентных клеток рассматривается как способ замедления развития широкого спектра заболеваний, связанных со старением.

Отсутствие системной токсичности. В отличие от ряда низкомолекулярных сенолитиков и некоторых других терапевтических подходов применение иммуногена является безопасным и не сопровождается тяжёлыми побочными реакциями.

Таким образом, персонифицированный иммуноген, разработанный Ильёй Владимировичем Духовлиновым, представляет собой перспективную стратегию, направленную на смягчение последствий старения и продление периода здоровой и активной жизни.

В настоящее время технология находится на этапе регистрации.

Начать подготовку к такой вакцинации можно уже сейчас, используя кремы линейки БХ – Альфа Тимус, РТД-1, ИнФРа и Ипаморелин.